Production of polyclonal antibodies against extracellular matrix ECN molecules

Resumo

A matriz extracelular (MEC) é uma complexa rede de moléculas secretadas que preenchem o espaço extracelular. Biologicamente, MEC está relacionada com uma grande variedade de funções celulares que refletem a intensa atividade bioquímica desta estrutura. A MEC composta de moléculas multifuncionais como laminina, entactina, libronectina, vitronectina, colágenos, proteoglicanos entre outras.
O objetivo do presente estudo foi a produção de reagentes associados à
matriz extracelular; moléculas purificadas e anticorpos policlonais monoespecíficos. A laminina e a entactina foram isoladas do tumor de Engelbreath-Holm-Swarm (EHS), fibronectina e vitronectina foram purificadas a partir de plasma humano, e o colágeno tipo I foi extraído de tendão de cauda de rato. Após o isolamento, todas estas moléculas da MEC foram submetidas a uma eletroforese SDS-PAGE em gel preparativo e então, injetadas em coelhos usando poliacrilamida ou adjuvante de Freund (completo/incompleto). Após sucessivas imunizações, sangue foi coletado dos animais e a especificidade dos soros hiperimunes avaliadas através de técnicas de western-blotting, dot-blotting e imunohistoquímica. Anticorpos monoespecíficos que reconhecem estas diversas moléculas da matrix extracelular constituem excelentes ferramentas para estudos morfológicos e bioquímicos desta complexa estrutura tecidual.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is a complex network of secreted macromolecules that fills the extracellular space. Biologically, ECM is related to a large variety of cellular functions which reflect the broad biochemical activity of this structure. ECM is composed of multifunctional molecules such as laminin, enlactin, fibronectin, vitronectin, collagens. proteoglycans and others. The objective of the present study was to procluce ECM-associated reagents, i.e., purified molecules and monospecific polyclonal antibodies. Laminin and entactin were isolated from Engelbreath-Holm-Swarm (EHS) tumors, fibronectin and vitronectin were purified from human blood plasma, and type I collagen was extracted from rat tail tendon. After isolation, all of these ECM molecules were submitted to preparative SDS-PAGE and then injected into rabbits using polyacyamde or Freund complete/incomplete adjuvants. After successive immunizations, blood was collected and antibody specifities were checked by western-blotting, dot-blotting and immunohystochemistry techniques. Monospecific antibodies against the major ECM molecules can be excellent tools for morphological and biochemical studies of these complex tissues structures.